免疫印迹技术服务(western blot)

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免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(western blot)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹(western blot)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹(western blot)常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

闪晶生物为您提供全套免疫印迹(western blot)技术服务和相关的试剂耗材。主要实验步骤如下：

• 蛋白质抽提
  • 实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
  • 实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE):将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4. 蛋白质转移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5. western blot膜的封闭和抗体孵育

• 膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
• 封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
• 加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6. western blot结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7. western blot数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8. 提供实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关数据。
更详细的操作说明
Western Blot操作规程

western blot费用：每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品。每张膜的费用是：1500.00元。一抗另计，其它试剂免费，一抗订购时间约为3周。乘车路线：火车站坐1号地铁到徐家汇站，然后坐205路车到桂林路站或者打车到公司地址即可。
时间：约2－3周。
联系：master@shinegene.org.cn 电话：021-64858053-11

Western Blot相关的试剂和耗材

产　品　名　称

包　装

单　价(RMB)

Trypsin-EDTA

0.25%,100ml

150.00

蛋白裂解液（蛋白提取液）

10ml

60.00

PMSF

100mM 10ml

86.00

40% Acr/Bis (37.5:1)

100ml

100.00

40% Acr/Bis (29:1)

100ml

100.00

40% Acr/Bis (19:1)

100ml

100.00

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液

5x,1ml

28.00

SDS-PAGE电泳缓冲液

10x,500ml

100.00

蛋白胶快速染色液

100ml

120.00

蛋白转移缓冲液

10x,500ml

100.00

可逆型转移膜染色液

100ml

120.00

Tris-HCl Buffer,PH6.8(配浓缩胶）

0.5M, 250ml

100.00

Tris-HCl Buffer,PH8.8(配分离胶）

1.5M, 250ml

100.00

PBS buffer

20x,500ml

100.00

PBST buffer

20x,500ml

100.00

TBST buffer

20x,500ml

100.00

TBS buffer

20x,500ml

100.00

SDS

10%,100ml

100.00

洗脱抗体缓冲液(膜再生液）

100ml

100.00

二抗-HRP

0.2mg

175.00

预染Marker（20~120kDa）

250ul

200.00

ECL化学发光试剂

25ml

200.00

显影液

250ml

45.00

定影液

250ml

45.00

硝酸纤维素膜NC膜

15cm*20cm

60.00

PVDF膜

13.5cm*15cm

80.00

3MM滤纸

27cm*1M

40.00

X线暗盒

5*7int.

600.00

柯达X光胶片

5*7int. 100/pk

200.00

乳胶手套

100/pk

65.00

PE薄膜手套

100/pk

5.00

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